¿Qué es el ADN-Barcoding?
ADN-Barcoding es una técnica de estudio genético que utiliza un fragmento de una secuencia de ADN para identificar el organismo al que pertenece y asignarlo a una especie concreta.Para el barcoding se necesita uno o varios marcadores genéticos universales presentes en todas las especies. Estos marcadores han de poder ser secuenciados, con la variabilidad suficiente para distinguir especies, pero rodeados de regiones suficientemente conservadas para que los cebadores universales puedan amplificarlos.
Con la generalización del barcoding a un gran número de grupos de organismos es posible generar bases de datos con las secuencias de cada marcador para diferentes especies. Este hecho permite la extensión de la técnica al metabarcoding.
¿Qué es el metabarcoding?
Con el avance de la tecnología de secuenciación se ha hecho posible secuenciar muestras de ADN heterogéneo con múltiples fragmentos de ADN distintos para poder identificar múltiples organismos a la vez, a esto se lo conoce como metabarcoding.Con esta tecnología se puede identificar taxonómicamente la composición de toda una comunidad a partir de muestras ambientales, en las que se puede amplificar miles de pequeños fragmentos de ADN contenidos en el ambiente y saber a qué organismos corresponden usando las bases de datos generadas con el ADN-barcoding.
Las técnicas de metabarcoding han revolucionado el seguimiento de comunidades biológicas, analizando muestras ambientales con secuenciación de alto rendimiento se puede identificar automáticamente las especies presentes en un ambiente a partir de unas muestras y unas bases de datos de taxonomía molecular. Con estas técnicas se puede detectar y asignar los diferentes fragmentos de ADN presentes en muestras de ADN ambiental, esto incluye ADN de la comunidad, correspondiente a organismos vivos y también ADN extra-organísmico, proveniente de organismos muertos, tejidos, exudaciones, material reproductivo, materias fecales o ADN extracelular, incluido ADN disuelto en el agua.
Metabarcoding en comunidades bentónicas marinas de sustrato duro
Los métodos de metabarcoding se han estado aplicando para caracterizar biodiversidad microscópica en diferentes sustratos relativamente homogéneos, como en plancton, sedimentos marinos o tierra. Sin embargo, en sustratos más heterogéneos como las comunidades de fondos duros y para la identificación de organismos más complejos los métodos están mucho menos desarrollados. Esto se debe a un complicado método para muestrear cuantitativa y eficientemente, la falta de cebadores universales útiles para amplificar la gran variedad de grupos taxonómicos presentes en estas comunidades, una necesidad de algoritmos bioinformáticos para trabajar con gran cantidad de secuencias, y la falta de exhaustividad de las bases de datos, entre otros factores. |
| Comunidad esciáfila de macroalgas en fondo rocoso ( Parque Nacional Archipiélago de Cabrera) |
OBTENCIÓN DE MUESTRAS
Un problema al que se enfrenta el estudio de estas comunidades es realizar un muestreo que sea representativo de la estructura y complejidad de la comunidad. En comunidades más complejas y heterogéneas es necesario una mayor cantidad de muestras y réplicas para obtener resultados significativos que reflejen la complejidad de esa comunidad. Tampoco se quiere realizar un muestreo excesivo ya que estas técnicas suelen ser destructivas y requieren un tratamiento complejo en el laboratorio.Otro factor a tener en cuenta en las muestras de metabarcoding de comunidades algales marinas es el amplio rango de tamaños de los distintos organismos de la comunidad, ya que en la mayoría de estudios de metabarcoding los organismos objetivo suelen ser de tamaños similares mientras que en estos bosques de algas hay organismos con varios órdenes de magnitud de diferencia en el tamaño yendo desde macro organismos como esponjas y corales hasta organismos microscópicos.
La variedad de organismos diferentes presentes en estas comunidades también se representa en un amplio rango de durezas y composiciones distintas de sustratos y organismos, lo que dificulta el trabajo de preparación de las muestras y extracción del ADN.
Para la obtención de muestras, mediante buceo autónomo, se hace un raspado de estas comunidades de una área concreta (cuadrados de 25x25 cm en comunidades algales i “corers” de 20cm de diámetro en fondos de Maerl) .
Estas muestras son almacenadas en alcohol después del muestreo para conservar correctamente el ADN y poder tratarlas en el laboratorio.
Comunidades antes de ser muestreadas, Comunidad esciáfila de macroalgas y fondo de mëerl ( Islas Cíes Parque Nacional de Islas Atlánticas de Galicia).
PROCESADO DE LAS MUESTRAS Y EXTRACCIÓN DEL ADN
Para poder extraer el ADN de una comunidad tan compleja es necesario separarla en muestras bien homogéneas. Las muestras se separan en 3 tamices de diferentes tamaños, con mallas de 10mm, 1mm y 63µm, donde se filtran y lavan con agua. Luego las fracciones son homogeneizadas y almacenadas en etanol hasta su extracción de ADN.
En el proceso de lavado y filtrado las partículas menores de 63 micras no quedarán en la muestra. De este modo el ADN extra organísmico y el de organismos menores de 63 µm (incluyendo bacterias) no aparecerán prácticamente en la muestra.
Filtrado de las muestras con los tres tamices de distinto tamaño de malla y muestras finales previas a la seceunciación.
MARCADORES GENÉTICOS
Para poder realizar metabarcoding hay que escoger un marcador genético adecuado, en una región genómica con suficiente variabilidad que nos permita distinguir entre diferentes especies y niveles taxonómicos cuando este sea leído en la secuenciación del ADN. Para esto son idóneos los fragmentos de ADN mitocondriales, del cloroplasto o ribosómicos. Al escoger el marcador genético hay que tener en cuenta la longitud de este fragmento, fragmentos cortos harán más fácil la tarea de metabarcoding y disminuirán las tasas de error; y el diseño de primers (cebadores) del fragmento, según si se utilizan primers más específicos o universales en función del objetivo y especificidad de la investigación. Los marcadores como COI (citocromo oxidasa I) y 18S (ADNr) son los más utilizados en metabarcoding de eucariotas.
SECUENCIACIÓN DE ALTO RENDIMIENTO I ANÁLISIS BIOINFORMÁTICO
Una vez escogido el marcador, las muestras se amplifican mediante PCR que ampliarán los marcadores de metabarcoding en cada muestra y estarán listas para ser secuenciadas. A su vez, los cebadores incluyen una corta etiqueta genética de cada muestra para así poder secuenciar muchas muestras a la vez.
Hay distintas tecnologías de secuenciación de alto rendimiento para metabarcoding que varían en el número y longitud de lecturas de las secuencias del ADN. La secuenciación de extremos pareados permite leer la secuencia de ambos extremos de un pequeño fragmento de ADN dando dos lecturas pares que serán alineadas en el análisis bioinformático de los resultados y tratados como una sola secuencia.
Se puede realizar el análisis de los datos obtenidos en la secuenciación masiva con diferentes métodos bioinformáticos, generalmente siguen los siguientes pasos:
- Control de calidad y lectura de las etiquetas genéticas para asignar cada lectura a la muestra original.
- Agrupación de las secuencias que pasen el control de calidad en MOTUs ( Identificador molecular para “especies” (Mobile Operational Taxonomic Unit))
- Asignación de los MOTUs a un nivel taxonómico (especie, género, familia, etc).
A estos procesos los acompaña una base de datos fiable, que integre el conocimiento taxonómico clásico y los métodos de secuenciación genéticos. Se pueden dar errores de secuenciación, que muestren demasiada divergencia entre organismos o secuencias debido a una mala amplificación de ADN, o amplificación del ADN de un organismo simbionte u otros. Estos fallos deben eliminarse de las bases de datos de referencia. Según el marcador genético que se utilice hay distintas bases de datos; para el COI, utilizamos normalmente la base de datos del proyecto BOLD (Barcode of Life Data System).
La asignación taxonómica también conlleva algunos problemas, en general ligados a errores o falta de compleción de las bases de datos que impiden la asignación taxonómica correcta de algunas secuencias y dan como resultado la asignación de niveles taxonómicos superiores o menos específicos. Con la mejora y crecimiento de las bases de datos estas asignaciones cada vez son más correctas y fiables.
Para acabar la matriz final de datos, se realizan una serie de correcciones y calibraciones en base a muestras control, normalizaciones de los resultados y una eliminación manual de resultados incoherentes ( secuencias contaminadas de origen humano, bovino u otros falsos positivos).
RESULTADOS
El resultado básico del metabarcoding es una tabla con todos los MOTUs (unidades moleculares equivalentes a especies) detectados en cada muestra y su abundancia en número de lecturas. Luego se añaden los grupos taxonómicos que se asignan y el grado de similitud con secuencias cercanas en la base de datos. Estas tablas indican principalmente la presencia y abundancia del grupo taxonómico asignado al MOTU.
Estas técnicas de estudio de metabarcoding suelen ir acompañadas de seguimientos y muestreos ecológicos y ambientales con los que realizar estudios de los resultados más completos e integrados.
FUTURO DEL METABARCODING
Los métodos de seguimiento genético utilizando metabarcoding en comunidades marinas son un campo de estudio en crecimiento, habiendo cada vez más estudios y trabajos en este sector. Permiten completar los estudios taxonómicos y ecológicos tradicionales con los moleculares, y son una herramienta muy útil y eficaz para la evaluación de la biodiversidad.
El monitoreo desde el punto de vista molecular suele identificar un mayor número de especies y taxones en las comunidades estudiadas que con un seguimiento morfológico, con lo que pasarían desapercibidos muchos organismos, como especies microbianas, endosimbiontes u otro tipo de meiofauna que podría desempeñar roles clave para los ecosistemas. A su vez, al no requerir especialistas taxónomos, estos métodos de identificación molecular añaden un punto de objetividad a la asignación de especies en dichas comunidades, y nos proporcionan información de variabilidad inter- e intraespecífica entre organismos. Con el aumento de estas técnicas de estudio están creciendo y mejorando las bases de datos de referencia que permiten la identificación de especies y secuencias que ahora no se pueden asignar a ningún taxón puede que en un futuro cercano se identifiquen a nivel de especie u otro nivel taxonómico.
Mejoras tanto en en los métodos de muestreo y procesado de muestras como en la tecnología de secuenciación y amplificación de ADN, y los procesos bioinformáticos, junto con un aumento en la cantidad de estudios y trabajos de este campo permitirán revolucionar los estudios de biodiversidad haciéndolos más rápidos, sencillos y eficaces.
METABARCODING EN EL PROYECTO BIGPARK
En este proyecto continuamos un seguimiento genético utilizando metabarcoding en comunidades marinas de sustrato duro, iniciado en proyectos anteriores (Metabarpark 2014), cuyo objetivo son comunidades con influencia de algas invasoras en los Parques Nacionales del Archipiélago de Cabrera y las Islas Cíes del Parque Nacional de Islas Atlánticas de Galicia.
Hasta hace poco no había precedentes en estudios de comunidades marinas complejas de sustrato duro utilizando metabaracoding. En el proyecto previo (METABARPARK) se puso a prueba la técnica y metodología para ser aplicada a estas comunidades y se inició un seguimiento de comunidades representativas en los Parques Nacionales de Islas Atlánticas y del Archipiélago de Cabrera. Con este proyecto se prolonga el seguimiento y estudio de estas comunidades para obtener una serie temporal de más de 6 años (2014-2021) para la evolución de comunidades nativas e invadidas por algas invasoras. Más recientemente se ha añadido al proyecto un análisis genético de la ictiofauna a partir de muestras de agua.
En los dos Parques se estudiarán dos tipos de comunidades: fondos rocosos someros ocupados por algas fotófilas y fondos circalitorales (ocupados por algas esciáfilas), y en Islas Cíes se añade un seguimiento de fondos de Maerl. En los diferentes fondos se hará un seguimiento de comunidades con y sin algas foráneas, entre las cuales se incluyen Caulerpa cylindracea, Lophocladia lallemandii y Asparagopsis armata, entre otras.
Comunidades invadidas por Caulerpa cylindracea ( PN Cabrera), Lophocladia lallemandii (PN Cabrera) y Asparagopsis armata ( PN Islas Atlánticas)
Para la toma de muestras se han realizado campañas de muestreo en ambos Parques, en los que se obtuvieron y conservaron las muestras de comunidades para ser tratadas luego en el laboratorio en el CEAB ( Centro Estudios Avanzados de Blanes), donde se extrae y amplifica el ADN de las muestras y luego se envía a la Universidad de Tromso donde se realiza la secuenciación.
Los resultados de estos análisis genéticos nos indican la diversidad de estas comunidades de forma cuantitativa y cualitativa, lo que combinado con seguimientos ecológicos y datos ambientales nos permiten hacer un seguimiento y estudio mucho más completo e integrado de estas comunidades y ecosistemas.
